- megablastn方法->megablastnresult(2hits）
- blastn方法->blastnresult(7hits)
- tblastn方法->筛选掉evalue>0的序列(11hits-3hits)->tblastnresult(8hits)
- 同源注释：下载几个其他代表性动植物的完整的蛋白集, 使用 TblastN 将蛋白序列比对到初步组装结果的序列上，E-value的阈值为1e-5. 将不同蛋白的BLAST的hits用 Solar 软件进行合并。GeneWise 根据每个BLAST hit的对应基因区域预测完整的基因结构。 同源预测软件通常利用GeneWise和GeneMoMa，前者是需要同源物种的蛋白序列，后者需要同源物种基因组序列及对应的GFF文件，目前小编已经抛弃GeneWise，使用最多的就是GeneMoMa，但是让小编十分头疼的是在准备GFF文件太花费精力，这个软件真的是挑肥拣瘦，必须满足其格式才能可以运行，目前从NCBI的Reseq和Ensemble上下载都可以，其他地方来的那就得还点时间写个脚本改下了。
- 转录组预测：用Tophat将RNA-seq数据比对到初步组装结果的序列上，然后用cufflinks组装转录本形成基因模型。 转录组数据预测PASA软件是基于Unigene/EST序列进行预测软件，这个可能就需要拿到一个混样转录组数据首先进行无参组装，接下来根据Unigene组装结果在进行比对，通常用Gmap或Blat两种方法，最好三代全长转录本和二代一起来进行预测，这样可以使得找到的结构更为准确、可靠，此外PASA还有另外的一个功能就是可以用其预测可变剪切，俗称PASA修饰。
- 从头预测：先构建repeat-mask genome， 在这个基础上就用 August, Genescan, GlimmerHMM, Geneid 和 SNAP 预测编码区
- 新鲜出炉的NLP序列，提取DNA序列->预测ORF+blast结果NLP基因
- 使用megaX翻译序列->预测ORF+blast结果NLP基因.AA.fas
- 使用Clustal Omega进行序列比对，使用Jalview美化->
- 使用SignalP5.0进行信号肽预测，使用SecretomeP2.0进行非经典分泌预测->序列信息.xls
typeⅢ Afu5g02100 = XP_748132.1 conserved hypothetical protein [Aspergillus fumigatus Af293]typeⅠ PsojNIP = AAM48170.1 necrosis-inducing protein [Phytophthora sojae]typeⅡ NLPPcc = ACT13867.1 Necrosis inducing protein [Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PC1]
使用BlastP方法对nr数据库进行比对，取identify>=80%的序列，evalue小于1e-5的序列，并人工筛选在100aa到300aa的序列。
整理了 仓库 :添加了几个文件夹
得到了三个输出结果，并将其合并在123汇总.fa中。
待进行的任务 : 从文章中摘取他人已经鉴定好的NLP序列，并放进卵菌参考序列中。
用上一步得到的blastp结果，同鉴定的PvNLP序列进行多序列比对，并绘制NJ系统发育树。使用evolview
进行系统发育树的美化。将亲缘关系较近的leaf collapsed。
大豆疫霉，采用四个序列作为query进行blastp比对，取identify>=50%的序列，evalue小于1e-5的序列，并人工筛选在100aa到300aa的序列，并删除不完整序列，重命名。
OK,之前做的就算是白做啦。 我们重新绘制系统发育树。并通过系统发育树预测PvNLP蛋白的功能性。使用Comparative and Functional Analysis of the Widely Occurring Family of Nep1-Like Proteins这个dalao的文章中的数据，基于533个来自真菌，细菌，卵菌三个界，与已经鉴定的7个PvNLP蛋白绘制系统发育树。通过序列在该树中的离散情况，判定其对应功能。